如何核查 PCR 与 qPCR 引物序列是否正确

本文讨论的是“已有引物的核查”，而不是从零开始设计引物。任何单一在线工具都不能替代实验验证；网页预测结果应结合模板类型、物种、转录本、扩增片段长度、熔解曲线和凝胶电泳结果综合判断。

核查现有引物的常用工具

NCBI Primer-BLAST同时输入上下游引物，检查预期扩增产物及潜在非特异产物，是本文的首选核查方法。

NCBI Nucleotide BLAST分别核查单条引物与数据库序列的匹配情况，适合进一步查看目标序列、E值、得分和局部比对。

UCSC In-Silico PCR在指定基因组组装或转录本集合中预测一对引物的扩增位置和产物。

理化性质与二级结构工具可进一步评价GC含量、Tm、发卡结构和引物二聚体；本教程暂不展开。

审核时建议优先核对五件事：物种是否正确、模板类型是否匹配、目标基因和转录本是否正确、预测产物长度是否合理，以及是否存在具有实际扩增可能的非特异产物。

一使用 Primer-BLAST 核查一对引物

Primer-BLAST 如何判断特异性

NCBI数据库收录多种物种的基因组DNA、mRNA及其他核酸序列。Primer-BLAST会查找两条引物可能结合的位置，并判断这些结合位点能否以合适方向和距离形成PCR产物。它不仅检查常见的正向—反向组合，也会考虑正向—正向和反向—反向组合可能产生的非特异扩增。

进入NCBI网站。
打开NCBI主页，进入BLAST相关工具。
图1　进入NCBI网站。
打开BLAST工具。
在Popular Resources中选择BLAST，进入工具主页。
图2　NCBI主页中的BLAST入口。
图3　BLAST工具主页。
选择Primer-BLAST并输入引物。
将正向和反向引物均按5′→3′方向粘贴到相应输入框。预测产物范围可依据实验设计调整；qPCR扩增片段通常应保持较短。
图4　Primer-BLAST引物输入和产物长度设置。
设置物种、数据库和特异性参数。
确认已启用Specificity check；Search mode通常可先选择Automatic。人、小鼠和大鼠分别选择Homo sapiens、Mus musculus和Rattus norvegicus。
数据库应与实际模板一致：由RNA反转录得到的cDNA通常选择RefSeq mRNA；如需兼顾其他RNA转录本，可根据研究目的选择RefSeq RNA；基因组DNA模板则选择适当的参考基因组数据库。是否排除预测转录本，应由研究问题决定。
图5　物种、数据库与特异性检查设置。
提交并查看结果。
点击Get Primers提交。下图以人EGFR qPCR引物为例；出现多个目标结果可能是因为该基因存在多个转录变体，而这对引物能够覆盖其中多个变体。
图6　EGFR引物的Primer-BLAST结果示例。

Primer-BLAST结果应该看什么

每个预测产物至少需要核对三个部分：

目标记录：结果是否对应预期基因和物种；mRNA数据库通常提供NM等转录本编号，基因组数据库则显示相应组装记录。
预测产物长度：是否符合实验预设范围，是否与论文或实验记录中的扩增片段一致。
引物与模板的结合：核对正反向引物的方向、位置和碱基匹配，尤其关注3′端错配。

如果结果中还出现其他基因、非目标转录本或其他染色体位置，应进一步判断这些位点在当前模板和PCR条件下是否可能真正形成扩增产物。

Primer-BLAST非特异扩增结果原始截图 — 图7　Primer-BLAST显示的潜在非特异扩增结果。

发现非特异性结果后如何判断

发现潜在非特异结果，并不等于这对引物一定不可用；但也不能仅凭某一个条件直接忽略。应结合以下因素综合判断：

3′端匹配：引物3′端错配通常会明显降低延伸效率，但影响程度取决于错配的位置、数量、碱基类型和反应条件。
预测产物长度：远大于预期片段的非特异产物，在短延伸时间的qPCR条件下形成概率可能较低，但仍应结合实验条件判断。
模板是否存在：某些预测转录本可能不在研究组织或细胞中表达；基因组DNA污染也可能改变实际扩增结果。
实验结果：SYBR Green qPCR会检测所有双链DNA，因此还应查看熔解曲线、扩增曲线、凝胶条带和阴性对照。

审核要点：常规PCR同样需要关注特异性；SYBR Green qPCR对非特异扩增和引物二聚体尤其敏感。在线预测只能用于风险筛查，不能替代实验验证。

二使用 Nucleotide BLAST 核查单条引物

BLAST全称Basic Local Alignment Search Tool，用于查找生物序列之间的局部相似区域。Nucleotide BLAST在核苷酸数据库中搜索相似核酸序列；Protein BLAST搜索相似蛋白质序列；blastx将核苷酸序列翻译后搜索蛋白数据库；tblastn则用蛋白质序列搜索经过翻译的核苷酸数据库。

进入NCBI网站和BLAST主页。
图8　进入NCBI网站。
图9　选择BLAST工具。
选择Nucleotide BLAST。
审核核酸引物时通常使用Nucleotide BLAST。
图10　选择Nucleotide BLAST。
输入序列并设置搜索参数。
可以单独输入上游或下游引物，也可将两条序列按FASTA格式分别命名后输入。FASTA格式通常第一行以“>”开头并给出序列名称，后续行为核酸序列。
图11　输入序列并设置搜索参数。
图12　根据核查目的选择数据库。不同数据库可能返回不同结果。
提交搜索。
点击BLAST后等待系统完成计算并进入结果页面。
图13　BLAST任务提交后的等待页面。
查看结果页。
Description展示相似序列的基本信息；Graphic Summary以图形展示命中位置；Alignments给出具体序列比对；Taxonomy展示匹配记录的物种分类。
图14　Nucleotide BLAST详细结果页面。

Nucleotide BLAST结果应该怎样解读

1 先确认目标记录

首先检查高排名结果是否来自预期物种、目标基因和正确转录本。不能只看分值，而忽略序列名称与注释。

BLAST目标序列结果原始截图 — 图15　确认搜索结果是否对应目标基因和序列。

2 E value

E值反映在当前数据库规模下随机获得相似匹配的期望次数。E值越小，说明该匹配越不容易由随机事件产生；对于很短的引物序列，仍需结合比对长度和具体碱基位置判断。

3 Total Score

Total Score越高，通常表示总体比对得分越高，但它不能单独证明引物具有良好特异性。还需比较其他命中、比对覆盖及3′端匹配情况。

BLAST Total Score原始截图 — 图17　查看Total Score。

4 Identities

Identities表示完全匹配碱基占比。审核短引物时，应进一步打开具体Alignment，确认错配发生在5′端还是对扩增更关键的3′端。

BLAST Identities原始截图 — 图18　查看Identities。

5 Gaps

Gaps表示插入或缺失。对于短PCR引物，含gap的局部命中通常不是理想的完整结合，但不能仅凭gap数量判定整对引物合格与否；仍需回到一对引物是否能够形成实际扩增产物这一核心问题。

三使用 UCSC In-Silico PCR 核查预测产物

进入UCSC Genome Browser。
图20　UCSC Genome Browser首页。
打开In-Silico PCR。
图21　进入Tools中的In-Silico PCR。
选择物种和组装版本，输入上下游引物。
应确认物种、基因组组装版本和Target设置与研究一致，再将两条引物按5′→3′方向输入。
图22　设置物种、组装版本并输入引物。
提交并检查预测结果。
只出现一个与目标一致的预测产物是支持引物特异性的证据，但不是充分证明；仍应结合数据库范围、转录本、错配参数和实验结果判断。
图23　查看预测扩增结果。
打开序列记录核对具体信息。
点击结果中的序列名称，确认染色体位置、目标基因、产物长度和序列内容。
图24　核对预测产物的详细信息。